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    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

    點(diǎn)擊次數(shù):2137  更新時(shí)間:2015-08-10

    抗體稀釋液

        其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可,但的抗體稀釋液中除PBS成份外,還加了*防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份,對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因,我一直用國(guó)產(chǎn)的抗體稀釋液,一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果(提示可能一抗沒(méi)有結(jié)合),zui后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后,發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸,而使抗原抗體反應(yīng)不佳,終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

        為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
    注意:

    ①單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。

    ②溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;

    ③沖洗的時(shí)間要足夠,才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。

    ④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn),當(dāng)時(shí)我買(mǎi)的抗體稀釋液偏酸,結(jié)果背景一片黃(未見(jiàn)特異性染色),建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強(qiáng)度則有利于分解)

    DAB顯色

        背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間,到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗;DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色,這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間;此外,若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間;DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如超過(guò)十幾分鐘)才出現(xiàn)陽(yáng)性染色,一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短(一抗4℃);另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

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